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高精确度的SNP检测

        在测序深度足够的情况下,PacBio RS第三代单分子实时测序平台的单碱基精确远高于二代测序平台,可做稀有SNP的检测。可以检测多个SNP的单倍体型 ,即两个临近的SNP在同一链上还是在不同链上。由于GC含量不影响单分子测序,片段读长长,可将靶片段准确定位到参考序列上,加上单分子测序的错误随机,没有PCR引入的偏向性系统误差,很容易通过提高覆盖度得到高准确的的数据。Broad研究院经过实验对比得出的结论,PacBio做SNP检测假阳性率低,在后续的SNP验证上是最好的技术手段。

     

白血病中的突变检测实例


      两个基因融合突变造成酪氨酸激酶通路产生的失调。其中一个基因突变会产生二级突变,这种突变会导致病人对激酶抑制剂药物产生抗药性。激酶区域突变有两种不同方式产生,一种是polycolonal突变,另一种是compound 方式产生。不同的突变方式导致对不同药物的不同抗药性。需要有好的方法在临床上区分两种突变产生以个性化用药。

     Nature发布的一篇文章,FLT3过去一直被认为是急性髓细胞白血病(AML)的有效治疗靶标,可患者接受靶向FLT3新药治疗后若复发会产生耐药性,导致对FLT3是否真正有效靶标产生质疑后来出现很多争议。

      FLT3呈受体结构,有一段激酶区域,还有一段称为ITD的重复序列,ITD上有很多突变,是过去药物筛选的靶标。这个研究针对ITD突变外部的二级突变与抗药性的关系。 

      研究发现ITD外部下游区也有很多二级突变产生,和抗药性有关。二级突变产生的频率很低,很难找到,所以不受重视,在很多研究中,没有将其与抗药性关联起来。长度超过1kb。这个长度二代测序是测不到的。传统Sanger技术可以了解突变的空间关系,但处理起来非常麻烦,还需要扩增,挑克隆。PacBio技术正好可以很容易解决这个问题。结果表明,在没用药前,ITD下游二级突变出现频率不高,但用药后二级突变出现频率升高。8个例子中,不同的病人出现突变的频率和模式是不同的,其中有的突变频率很低,不到3%。正是由于第三代测序对长片段及稀有突变的高灵敏度高准确度检测,重新证实了FLT3的确是有效的药物靶标。